2021-09
一、概述
原料药或者药物制剂有关物质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等。目前有关物质检测方法主要采用高效液相色谱法，在实际情况中我们经常会遇到同一个药物制剂在不同的质量标准中，采用不同的液相方法进行有关物质的检测，而最终会选择哪种方法作为产品中有关物质的检测方法，一般从以下几个方面进行评价：①对样品中杂质的检出能力，包括杂质的检出个数和检出量；（同步考察样品的制备方法是否可行）②对已知杂质的检出能力和分离能力；③检测波长的选择；④方法学验证结果是否符合可接受标准。
二、案例分析
2.1方法介绍
枸橼酸西地那非片质量标准收载于USP43和原研厂家标准WS1-(X-010)-2010Z，在这两个质量标准中均采用HPLC法等度洗脱方法且有关物质检验方法一致。另枸橼酸西地那非原料药EP10.0采用的是HPLC法梯度洗脱方法。
2021年04月06日国家药品监督管理局发布了枸橼酸西地那非片的国家药品标准修订件，其中有关物质的分析方法与EP10.0原料药有关物质梯度洗脱方法一致，并于2021年10月06日起执行。枸橼酸西地那非片有关物质检测方法正式由WS1-(X-010)-2010Z的等度洗脱方法升级为WS1-(X-010)-2010Z-2021梯度洗脱方法。
2.2 USP43与EP10.0有关物质检测方法杂质检出能力对比
两种方法对同一批样品检测结果如下：
结果表明，USP43和EP10.0两种检测方法检测制剂的有关物质，样品的制备方法均可行。系统适用性（分离度和灵敏度）均能符合要求，且检出杂质个数和杂质量相当。
2.3 USP43与EP10.0有关物质检测方法特定杂质分离度考察
采用EP10.0的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G和枸橼酸西地那非对照品，配制成单独的定位溶液和混合对照品溶液，在两种不同的色谱条件下进样，比较两种方法对已知杂质的杂质分离能力。
使用USP43色谱条件进行测定（DAD检测器），色谱柱使用Agilent SBC18(5μm，4.6*250nm)，各杂质定位溶液和混合对照品溶液图谱如下图。
使用EP10.0色谱条件进行测定（DAD检测器），色谱柱使用Agilent SBC18(5μm，4.6*250nm)，各杂质定位溶液和混合对照品溶液图谱如下图。
USP43枸橼酸西地那非片有关物质方法，杂质F与西地那非峰的出峰时间相同，杂质G洗脱不出来。EP10.0枸橼酸西地那非有关物质方法，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G和西地那非均可检出，且各成分峰间均能达到基线分离。EP有关物质的梯度洗脱方法对已知杂质的检出能力和分离能力优于USP等度洗脱方法。
2.4 USP43与EP10.0有关物质检测波长考察
对USP方法（检测波长290nm）和EP方法（检测波长230nm）进行比较，将各杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G和西地那非峰，提取UV光谱，各色谱峰UV光谱如下图。
UV光谱图显示各杂质在230nm和290nm的响应趋势保持一致。杂质A、杂质B、杂质F和西地那非的响应相当，杂质D和杂质C比西地那非响应偏高，杂质G比西地那非响应偏低。但各成分在230nm处的响应均高于290nm处的响应，即各杂质在230nm处均有较大吸收。综上所述可优选230nm波长作为有关物质的检测波长。
2.5分析方法验证
最后，对EP方法进行方法学验证，验证内容包括系统适用性、专属性（选择性及干扰、强制降解实验）、检测限和定量限、线性和范围、精密度（重复性和重现性）、准确度、溶液稳定性和耐用性。其中强制降解试验，各破坏样品所得色谱图中，西地那非峰与相邻的降解产物峰分离度≥1.5；各破坏样品所得色谱图中，西地那非色谱峰的纯度≥995；各破坏样品物料平衡应在95%~105%之间。各项的验证结果均符合可接受标准。至此，确定EP方法作为枸橼酸西地那非片有关物质的检测方法。
三、总结
USP43枸橼酸西地那非片有关物质方法，杂质F与西地那非峰的出峰时间相同，杂质G洗脱不出来。虽然从正常样品检测结果无明显差别，但对于后续稳定性样品检测，使用USP43枸橼酸西地那非片有关物质方法检测样品可能会导致杂质F和杂质G还有其它强保留降解杂质漏检的可能。因此选择EP10.0有关物质方法作为枸橼酸西地那非片有关物质分析方法，最新颁布的国家药品标准WS1-(X-010)-2010Z-2021同样选择了EP10.0方法进行有关物质的控制。
